一、如何设计质粒载体进行蓝白斑筛选
先连接T载体是为了提高转化效率一般来说市面上出售的T载体都进行了优化，容易连接片段（也就是效率较高），因此构建表达载体时有时会先连接T载体。同时T载体的测序引物比较明确（商业化的缘故），因此测序也方便一些。更重要的是，T载体往往设计了蓝白斑筛选的功能，插入片段的载体会呈现白色，这样也容易区分验证，不用每个单菌落都拿去做colony PCR或提质粒酶切验证。当然也不是绝对的，我们实验室就经常直接把片段酶切后连接表达载体，不经过T载体这一步，其实影响并不大。如果你的情况比较特殊（比如片段较大，或是对应的表达载体拷贝数较低等），可以考虑连接T载体，不然的话不是非常必要。
二、蓝白斑筛选的原理是什么
1、蓝白斑筛选是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法。
2、野生型大肠杆菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。在经人工插入外源基因后，突变型大肠杆菌的β半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，主要为α-互补与抗生素基因。蓝白斑筛选在指示培养基上，未转化质粒的菌落因无抗生素抗性而不能生长，重组质粒的菌落是白色的，非重组质粒的菌落是蓝色的，以颜色不同为依据直接筛选重组克隆的方法。
3、一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。
三、蓝白斑筛选的蓝白斑筛选原理
1、是重组子筛选的一种方法，一些载体带有β-半乳糖苷酶N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点，可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时。
2、α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。
3、一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子。
4、这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。
5、由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。
文章分享结束，蓝白斑筛选和蓝白斑筛选的原理的答案你都知道了吗？欢迎再次光临本站哦！
